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    时间:2017-03-07来源:龙8国际_龙8娱乐_龙8国际娱乐平台 本文已影响
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DEAE-纤维素健康人全血 3. PH7.4 0.01M磷酸缓冲液 4. 20%三氯醋酸水溶液按W/V比例配制 5. 蔗糖(研成细粉状) 6. PH8.6 0.025MBA巴比妥纳-巴比妥缓冲液,2M NaCL水溶液 7. 1.5%琼脂凝胶 8. 布氏漏斗、抽滤瓶、水泵、试管,烧杯,玻璃棒,滤纸试纸、蝴蝶铁架、透 析袋、离心机,746-电泳仪、754型分光光度计 三、操作步骤: (一)DEAE-纤维素预处理: 1、 称取DEAE-纤维素12克,均匀撒在事先盛有150ml 0.5NNaOH的烧杯中,人其自由沉降,放置40-50分钟,不时地用玻璃棒轻轻搅动。 2、 将湖状物移入垫有滤纸的布氏漏斗中,连接漏斗抽滤瓶,并用水泵抽干糊状物。立即将DEAE-纤维素移入烧杯中,加蒸馏水,浸泡20-30min并不时搅拌,再移入漏斗抽干,如此重复,至洗出的PH值等于8即可。 3、 将交换剂移入150ml 0.5N HCL中放置40-50min,不时轻轻搅动,移入布氏漏斗抽滤,再依同法用0.5N NaOH处理一次,时间不超过50min。 4、 重第2项操作,至抽滤液PH值等于8即可,最后PH7.4 0.01MPB液浸泡交换剂,抽干,再重复一次,然后将交换剂用相同PB调成糊状,保留至装柱。 (二) 装柱、平衡 1、 固定层析柱在蝴蝶铁架上,垂直。柱上方放置PH7.4 0.01MPB液的洗脱瓶,以乳胶管相连,柱底部有细胶管,装止水夹,调节流速。 2、 将上糊状物倾入柱中,打开柱底流出口,用烧杯接流出液,注意不能断层,纤维素中不允许进空气,柱上表面要平,上部要留有约3cm高空间。(三) 上样和洗脱 1、 将人血置离心机以2000rpm,10min离心,取出并用毛细吸管吸取10 ml人血清 装入透析袋,于烧杯内浸入40倍于血清体积的起始缓冲液中,置4℃冰箱内透 析过夜,中途更换两次缓冲液; 2、 打开柱上端塞子,用带有橡皮乳头的毛细吸管吸出交换剂表面的缓冲液,至仍 2mm厚的液面,以免空气进入; 3、 用清洁细吸管将已平衡好的血清样本原柱管内壁缓缓加在纤维素柱表面,调节 流速,使样品进入交换柱内,约3ml/10min; 4、 待液面还约2mm厚的样品时,用少量起始PB冲洗柱内壁,到PB进入交换剂 仍留有2mm后液面时,再冲洗二次,保持柱面平整; 5、 最后加适量起始缓冲液,连接洗脱瓶,流速调至30-40ml/cm2/h ; 6、 收集洗脱液与试管中,每管5ml,共收集12管。并从各管中取1-2滴,加20% 三氯醋酸1-2滴检测。 (四) 洗脱液抗原性鉴定 1、 用1.5%琼脂凝胶制版,根据下图用打孔器打孔: 2、 加样:中心孔加入兔抗人IgG,从收集的12管洗脱液中用毛细吸管吸取洗脱液 分别加入周围六孔,每孔所加样品的量以液面与孔测平齐为准; 3、 将琼脂板置湿盒内37℃温箱孵育24小时,观察结果。 (五) IgG纯度鉴定 1、 琼脂板制作:用1. 5%琼脂凝胶加热融化后倾注在载玻片上,玻片上放一条细玻 棒,等凝胶凝固后在玻棒上下两侧打孔,制成如图所示:2、 型分光光度 计测各管洗脱液在波长280nm的光密度值,第一个蛋白峰为IgG,收集有IgG 活性的三管洗脱液,混合后装于透析袋内,用蔗糖粉末将其包埋使其浓缩; 3、 加样:如图示上孔加入浓缩的IgG提取液,下孔加入正常人血清,将加样后的 琼脂板置于746-电泳仪上,用四层纱布条做桥,连接凝胶板与电极缓冲液。该 桥搭在凝胶上部分约5mm,尽量拉直,与胶面间不能有气泡; 4、 连接电源,调节指示电压至100V(端压约为5V/cm),电泳槽加盖后,电泳至血 清蛋白迁移至距正极段边缘1cm处,关闭电源; 5、 凝胶板与桌面,取出玻条,凝胶中部既成一长槽,加兔抗人全血清加入槽内与 胶面水平; 6、 置凝胶板与湿盒内,于37℃或室温中孵育,12小时观察沉淀弧出现的情况。 7、 计算回收率:取透析袋内浓缩的提取液,用754型分光光度计测波长280的光密度值,如果超出测定范围,稀释后再测,按浓缩后IgG(mg/ml)=OD280×1.43×回收体积,正常人血清IgG:12(mg/ml) ×收集的血清体积,回收率=浓缩IgG/正常人血清IgG,计算回收率。四、实验结果: 1、DEAE-纤维素洗脱,收集洗脱液12管,均为略带黄色的液体,取样添加20%三氯 醋酸,各管中仅第4、5管出现浑浊,表明试管洗脱液中含蛋白质。其余管未见明显反应。 2、 745型分光光度计测出12管洗脱液的光密度(OD)值如下:做A280光密度值峰值曲线图如下: A280 a) 经过蔗糖粉末包埋后,收集到浓缩的IgG为3.5ml,测其OD值为3.52,此 值已经超出光密度计测定范围,取0。5ml浓缩液加2.5ml生理盐水稀释5 倍后测OD值为2.52。 b) 按下列方法计算IgG回收率: 浓缩后IgG:C(mg/ml)=OD280×1.43×体积(3. 5×5) 正常人血清IgG:12(mg/ml) × 体积(转 载于:wWw.xIeLw.com 写 论文 网:龙8国际_龙8娱乐_龙8国际娱乐平台)(8ml) 回收率=浓缩IgG/正常人血清IgG =2.52×1.43×3.5×5/12×8 =65.69% 3、 向琼脂扩散试验结果如下图,有白色成沉淀线出现,彼此相互融合相连。 4、 疫电泳(纯度鉴定)如下图,有沉淀弧出现,提取液与抗人全血清之间只出现一 条沉淀弧,并靠近凝胶板负极端,说明所提取IgG为纯品。人血清与抗人血清之 间由于存在多抗原抗体成分,所以出现多条沉淀弧。 五、分析与讨论: IgG是一种具有抗体活性的免疫球蛋白,其具有一般蛋白质的通性,是再次体液免疫应答产生的主要Ig。IgG主要由脾脏和淋巴结中浆细胞合成,含量高(在血清中含量最高),分布广,它能与抗原特异性结合,从而在体内介导多种生理和病理效应。 本次试验是利用离子交换剂的特性,血清中IgG不带电荷或仅带少量电荷,其它的蛋白质则主要带负电荷,使人血清通过带阳离子DEAE-纤维素制成的交换剂,带负电荷的蛋白质与阳离子交换剂结合,而不带电荷的IgG处于游离状态,用PH7.4的磷酸缓冲液通过层析柱,未结合的IgG随洗脱液 一起流出,试管收集,这样使血清样品通过DEAE-纤维柱而得以分离出IgG。收集的洗脱液颜色略带黄色,可能是收集血清时吸入了破碎的红细胞。在加入三氯醋酸后4、5管出现沉淀,说明从第4管开始有大量的IgG存在,IgG峰值集中在3、4、5三管,并峰值上升和下降很快,未见馒头峰,证明洗脱较好。 本次试验已成功地收集了IgG。从双向琼脂扩散试验的结果看,中间孔抗人IgG与周围孔的提取液IgG之间的凝胶出现一条白色沉淀线,3、4、5孔之间形成的沉淀线相互吻合,这说明IgG与抗体抗人IgG浓度相当,提取液为单一抗原,即IgG。通过免疫电泳结果看:在滴加浓缩提取液的一测出现一条沉淀弧,说明浓缩提取液中只有一种抗原物质,而在滴加正常人血清的一测出现多条沉淀弧,说明正常人血清中存在多种抗原物质。所以,通过以上两个试验证明:经分离提取的为纯IgG。 根据回收率看本实验的提取及回收比较有效,亦可根据公式计算IgG的浓度为18.018mg/ml。篇三:免疫学实验教案 [键入公司名称] 免疫学实验教案 研究生教育实习 潘熙萍(Y20090201) 2011/1/14 [在此处键入文档的摘要。摘要通常是对文档内容的简短总结。在此处键入文档的摘要。摘要通常是对文档内容的简短总结。]实验一 免疫血清的制备 一、实验目的 熟悉免疫血清的制备过程; 了解动物实验的基本知识。 二、实验原理 将抗原物质经适当途径,按照预先制定的免疫方案免疫动物,经过一定时间,可刺激机体产生特异抗体并释放入血液,当血中抗体达到一定效价时采血,分离血清,即为特异性免疫血清(又称为抗血清)。因抗原具有多种表位,可激活多个克隆的B细胞活化产生抗体,因此,这种免疫血清又称为多克隆抗体。 本实验以绵羊红细胞(SRBC)作为免疫原,以家兔为免疫动物,制备兔抗养红细胞免疫血清(也称为溶血素) 三、器材和材料 1.动物 健康成年家兔,雄性,体重2-3kg;健康成年绵羊。 2.试剂 生理盐水、碘酒、75%酒精。 3.器材 剪刀、镊子、无菌注射器、量筒、无菌毛细滴管、无菌试管、离心管、三角烧瓶(200ml)、动物固定架、手术器械一套、塑料放血管等。 四、 实验步骤 1.抗原制备 (1)用碘酒和75% 消毒绵羊皮肤,抽取颈静脉血液,注入含有等量阿氏液的三角烧瓶内,混匀。阿氏液既有抗凝作用,又适于储存SRBC。分装后置4℃冰箱内,可使用3周。 (2)无菌取上述绵羊血于离心管中,用无菌生理盐水洗涤红细胞,2000r/min,离心5min,吸弃上清液和白细胞层,再用无菌生理盐水与SRBC混匀, 2000r/min,离心5min,重复3次。最后一次离心10min,以使血细胞沉积于管底,弃去上清液。 (3)根据红细胞积压,用生理盐水配成20%SRBC悬液。 2.免疫动物 (1)全班分为4组,每组选择健康雄性兔1只,用于免疫。(2)用全血和SRBC悬液按下述方案免疫兔子。 (3)试血 末次注射后第7天,耳静脉采血1ml ,分离血清,用试管凝集试验滴定效价。(1:2000以上可用) 3、分离血清 (1) 颈动脉放血(心脏采血)并收集于无菌三角烧瓶中凝固后4℃冰箱过夜,分离上层血清。然后2500r/min离心10min,收集收集上层血清。 (2)收集的血清经鉴定纯化后,小量分装,-20℃冻存。 五、实验结果 收获的血清应无菌,且无溶血现象。兔抗SRBC免疫血清的溶血效价应高于1:2000;兔抗人IgG免疫血清的效价应高于1:16。 六、 注意事项 抗原制备、免疫动物及采集血清等过程应注意菌操作; 免疫的途径、次数、间隔时间因抗原性状不同而异,应合理设计免疫方案,并更具具体情况加以调整; 再次注射免疫原时,要防治过敏反应发生。 实验二 免疫细胞的形态观察 一、实验目的 掌握微量采血及血涂片的制作方法; 学习使用光学显微镜观察免疫细胞 二、实验原理血涂片是临床化验中最常规的技术,也是血液学研究中的最基本技术。将血液样品制成单层细胞的涂片标本,经瑞氏(Wright)染液染色后,不同免疫细胞中的颗粒可以呈现不同的颜色。根据细胞中颗粒的颜色、大小及多少,再结合细胞的大小及细胞核的形态,就可以将免疫细胞进行分类计数。 三、器材和材料 器材:医用一次性采血针、酒精棉球、镊子、经脱脂洗净的载玻片等 试剂:瑞氏(Wright)染液,瑞特氏染料0.1克溶于60ml甲醇中,过滤。贮褐色瓶中备用。(配置时,要先将瑞特氏染料置研钵体内边研边滴加甲醇,使染料溶液得更好。) 四、实验步骤 1.采血 动物采血时先将耳部剪毛,酒精消毒后,刺破动物耳部皮肤,挤去第一滴血不要。 2.涂片 挤出第二滴血置于载玻片的一端,再取另一张边缘光滑的载玻片,斜置于血涂片的前缘,先向后稍移动轻轻触及血滴,使血液沿玻片端展开成线状,两玻片的角度以30~40O为宜(角度过大血膜较厚,角度小则血膜薄),轻轻将载玻片向前推进,即涂成血液薄膜(如图),推进时速度要一致,否则血膜成波浪形,厚薄不匀。 3.染色 待涂片在空气中完全干燥后,滴加数滴瑞氏染液盖满血膜为止,染色1~3min。然后滴加等量的缓冲液(pH6.4)或蒸馏水冲去染液,吸水纸吸干,镜检。 4.封片 经染色的涂片完全干燥后,用中性树胶封片保存。 5.观察 分别用低倍、高倍和油镜观察血涂片,分辨不同的血细胞类型。 五、实验结果 画出血细胞的形态,标出并分析比较各种免疫细胞类型和形态特征。 实验三 大鼠外周血单个核细胞的分离 一、实验目的 掌握鼠外周血单个核细胞的分离的原理及操作方法。 二、实验原理 血液中各有形成分的比重存在差异,利用比重为1.077、近于等渗的ficoll-hypaque混合溶液(又称淋巴细胞分层液)作密度梯度离心时,各种血液成分将按密度梯度重新聚集。血浆和血小板由于密度较低,故悬浮于分层液的上部;红细胞与粒细胞由于密度较大,故沉于分层液的底部;PBMC密度稍低于分层液,故位于分层液界面上,这样就可获得PBMC。 三、器材和材料 刻度离心管、吸管、试管、毛细吸管、橡皮乳头、载玻片、盖玻片、离心机等,pH7.2 Hanks液、肝素、生理盐水溶液,淋巴细胞分层液。 四、实验步骤 1.抽取静脉取血2ml,注入含0,1mL肝素溶液的无菌试管中混匀,使血液抗凝。用pH7.2 Hanks液将抗凝血稀释1倍。 2.离心管:3mLficoll-hypaque分离液,加入4mL稀释血液(缓慢)加至分离液上面,应注意保持两者界面清晰。 3.用水平离心机以2000r/min离心20min。 4.吸出单个核细胞转移入另一支离心管中,加4倍以上的Hanks液洗涤,混匀,1500r/min,弃上清,加入Hanks液洗涤细胞2次。 5.最后一次洗涤手,用Hanks溶液将细胞悬液还原至2mL,取样计数。 6.取2滴细胞悬液将2滴0.4%台盼蓝溶液混匀,静止5min后,取样做湿片镜检,活细胞无色,死细胞蓝色。 7. 细胞计数 五、注意事项 1、实验所用玻璃器皿应该洁净。如果制备的单个核细胞悬液用于细胞培养时,上述操作过程都要在无菌条件下进行,所用器材、试剂都应为无菌。 2、实验中的细胞得率与室温及分层液比重等有关。分层液应避光4℃保存。本  篇:《龙8国际_龙8娱乐_龙8国际娱乐平台》来源于:龙8国际_龙8娱乐_龙8国际娱乐平台 优秀范文,论文网站
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